David R. Clemmons1,* on behalf of the conference participants
1 Department of Medicine, University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, NC.
摘要:生長激素(GH)和胰島素樣生長因子I(IGF-I)測(cè)定廣泛用于GH分泌疾病的診斷、多種原因的矮身高兒童的評(píng)價(jià)、導(dǎo)致營養(yǎng)不良或分解代謝疾病的處理、以及GH和IGF-I替代治療的監(jiān)測(cè)。因此,特別需要準(zhǔn)確和精確測(cè)量這兩種肽類激素。生長激素研究學(xué)會(huì)、IGF-I學(xué)會(huì)和IFCC的代表召開了國際討論會(huì),討論了測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化、改善測(cè)定可比性的必要條件、影響解釋測(cè)試結(jié)果的變量、影響測(cè)量性能的技術(shù)因素、測(cè)定的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的提出與應(yīng)用。對(duì)于分析前條件、國際間可替代的參考標(biāo)準(zhǔn)物、抗體的特異性、基質(zhì)要求、QC分析和結(jié)合蛋白的干擾給以了特別的注意。對(duì)測(cè)定每種肽的每一種變量都提出了建議。此外,考慮到Tanner發(fā)育分級(jí),以及體重指數(shù)的影響,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的年齡范圍推薦了IGF-I的特定標(biāo)準(zhǔn)。
共識(shí)聲明結(jié)論,在測(cè)定性能和可比性方面必須做重大改進(jìn)。工作組推薦了世界范圍內(nèi)使用的每種方法的可替代標(biāo)準(zhǔn)品,這些建議的應(yīng)用可提供可靠的和有臨床價(jià)值的測(cè)定結(jié)果,Clinical Chemistry, 2011, 57:(4):555–559.
循環(huán)系生長激素和胰島素樣生長因子I(IGF-I)濃度的測(cè)量是診斷和監(jiān)測(cè)垂體和其它疾病的基礎(chǔ),例如與GH有關(guān)的肢端肥大癥和GH缺乏,以及許多代謝性疾病。
當(dāng)前應(yīng)用的GH和IGF-I測(cè)定方法之間存在相當(dāng)大的差別。這些差別很大程度上是由測(cè)定特點(diǎn)的異質(zhì)性所致。為了GH-IGF-I軸疾病的管理提供清晰而有價(jià)值的指南,需要統(tǒng)一GH和IGF-I測(cè)定方法,使其具有可比性。生長激素研究學(xué)會(huì)(Growth Hormone Research Society,GHRS)與國際臨床化學(xué)家聯(lián)合會(huì)(International Federation of Clinical Chemists,IFCC)、國際IGF研究學(xué)會(huì)(International Society for IGF Research,IS-IGFR)和垂體學(xué)會(huì)(Pituitary Society,PS)協(xié)作,組織了一次專家討論會(huì),確定GH和IGF-I測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)、策略和一致性的貫徹方法。本文報(bào)告討論會(huì)的建議。
GH和IGF-I測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的當(dāng)前障礙
要討論測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的基本障礙需要了解免疫測(cè)定的性質(zhì)和固有的局限性。由于缺乏GH和IGF-I測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化,導(dǎo)致了不同測(cè)定方法測(cè)定的激素濃度值有重大差異,一個(gè)主要的原因是使用了不同的校準(zhǔn)物。目前,不是所有的GH測(cè)定都使用通用的國際參考制劑校準(zhǔn)。此外,已經(jīng)認(rèn)識(shí)到現(xiàn)有的IGF-I測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物,87/518(WHO),賦值濃度不正確。異質(zhì)性分析物產(chǎn)生了額外的問題。例如,循環(huán)的GH由不同的形式所構(gòu)成,包括單體、二聚體和其它翻譯后被修飾的產(chǎn)物,不同測(cè)定方法所能檢測(cè)到的有所不同。所以,因?yàn)樗褂玫臏y(cè)定方法不同,以及不同的抗體與不同GH和IGF-I分子構(gòu)成的結(jié)合力不同,不同測(cè)定方法測(cè)定的個(gè)體GH或IGF-I樣本可能得到很不同的結(jié)果。測(cè)定結(jié)果的報(bào)告也不相同,例如,GH測(cè)定結(jié)果不僅以質(zhì)量單位表示,而且也以國際單位表示,國際單位是武斷的定義,與質(zhì)量沒有清晰的關(guān)系。GH測(cè)定受到許多因素的干擾,其中包括GH結(jié)合蛋白(GHBP),即循環(huán)中的GH受體的細(xì)胞外區(qū)域。IGF結(jié)合蛋白(IGFBPs)也同樣可能干擾IGF-I的測(cè)定。對(duì)于任何一種測(cè)定方法,基質(zhì)成分也可能對(duì)GH和IGF-I測(cè)定有不同干擾。對(duì)所使用的測(cè)定方法來說,這些變量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不總是顯而易見的。
改善測(cè)定可比性的一般要求
改善GH和IGF-I測(cè)定方法可比性的最重要的要求是對(duì)每種激素使用唯一普遍認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。每種GH和IGF-I測(cè)定方法也應(yīng)當(dāng)詳細(xì)說明所要測(cè)量的分析物,所使用抗體的特異性以及測(cè)定方法對(duì)結(jié)合蛋白干擾的易受性。如果已知,也要說明抗體的抗原決定基。對(duì)每種GH和IGF-I測(cè)定方法都需要有標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。測(cè)定方法的可比性也需要對(duì)分析前條件的標(biāo)準(zhǔn)化、對(duì)基質(zhì)性質(zhì)的了解、實(shí)施適當(dāng)?shù)膬?nèi)部QC(質(zhì)量控制程序),以及外部QC程序的參與。
GH的測(cè)定
分析前條件
雖然某些分析物易受許多自然條件的影響,但GH和IGF-I是相對(duì)穩(wěn)定的。根據(jù)它們?cè)谘褐械姆€(wěn)定性,建議在搜集血樣的2小時(shí)內(nèi)分離血清和血細(xì)胞。在-20℃下數(shù)周內(nèi)GH和IGF-I是穩(wěn)定的。在GH缺乏或肢端肥大癥的動(dòng)態(tài)測(cè)定取樣的臨床條件要隨試驗(yàn)和評(píng)價(jià)的病人人群而有所不同,要在已經(jīng)發(fā)表的方案指導(dǎo)下進(jìn)行這些動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。
標(biāo)準(zhǔn)品和抗體的特異性
如果使用通用的純標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn),那么可以減小GH測(cè)定方法之間的差異。最近提出了一種新的制劑,第二代生長激素標(biāo)準(zhǔn)品(源于重組DNA的人GH,國際標(biāo)準(zhǔn)(IS)98/574),為GH測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化制造商正在使用這種標(biāo)準(zhǔn)品,國家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所(NIBSC)可提供。這種物質(zhì)有高純度(>96% 22-kDa GH)并具有滿意的特征(生物活性,穩(wěn)定性,有效性等),但仍未發(fā)表其可代替的論證文獻(xiàn)。根據(jù)可替代性確認(rèn)的重要性來看,強(qiáng)烈建議發(fā)表同行評(píng)議的出版物。如果在不同的方法中是可被替代的,我們建議所有的制造商采用這種標(biāo)準(zhǔn)品,以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化的一致性。IS 98/574每安培1.95mg的單位量,1mg等于3IU。我們建議以質(zhì)量單位報(bào)告GH濃度。
理想的測(cè)定方法應(yīng)當(dāng)使用高親和力和特異性的抗體。測(cè)定方法應(yīng)當(dāng)對(duì)人GH的22-kDa有特效。最關(guān)鍵的是在分析區(qū)間下限附近的可重復(fù)性。GH以脈沖式分泌,某些值可能很低。在診斷和監(jiān)測(cè)肢端肥大癥中使用葡萄糖抑制GH的能力,因此,因此廠商能夠提供GH測(cè)定區(qū)間下限的準(zhǔn)確測(cè)量是很重要的。目前,我們建議測(cè)定方法達(dá)到的下限量為0.05ug/l,變異系數(shù)(CV)<20%。
基質(zhì)的要求
校準(zhǔn)品所使用的基質(zhì)應(yīng)當(dāng)盡可能地模擬非病理人血清的性質(zhì)。但是仍然可能殘留與基質(zhì)有關(guān)的偏差,需要以特定的測(cè)定方法以一定數(shù)值對(duì)校準(zhǔn)品給以修正。因?yàn)閷?duì)GH(或?qū)GF-I)沒有參考測(cè)量方法,所以,有必要使用特定方法的校準(zhǔn)品,用一批病人樣本證實(shí)一組常規(guī)方法之間的相同結(jié)果。如果沒有這樣的一組樣本,可能必須使用其它物種保持適宜線性和已知激素回收量的血清。
GHBP干擾
每種測(cè)定方法都應(yīng)詳細(xì)說明在GHBP生理范圍內(nèi)的干擾程度。為了研究這種干擾,樣本應(yīng)加入重組GHBP,至少孵化12小時(shí),使其在測(cè)定前形成GH/GHBP復(fù)合物。
質(zhì)量控制
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)使用測(cè)定廠商所提供之外的QC材料。所有測(cè)量GH的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)參加技術(shù)水平測(cè)試/外部質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃,使用在一個(gè)國家,甚至在國際上被證實(shí)可交換的材料,這樣的國際計(jì)劃能夠加快達(dá)到一致性。
當(dāng)有可交換的材料時(shí),我們鼓勵(lì)I(lǐng)FCC與國際病理學(xué)會(huì)協(xié)作,以促進(jìn)世界范圍內(nèi)的技術(shù)水平測(cè)試/外部質(zhì)量評(píng)估信息與報(bào)告的交流,共享最佳方法。一項(xiàng)可取的目標(biāo)是成立權(quán)威咨詢組,促進(jìn)國際水平上的共享。應(yīng)當(dāng)確立不同方法間的最佳方法的閾值,以保證質(zhì)量的可比性。每種測(cè)定方法特點(diǎn)描述必須包括確定該測(cè)定方法中GH每種主要形式的反應(yīng)性。
為了比較研究,需要匯集證實(shí)互通性和覆蓋臨床重要界值點(diǎn)(例如GH缺乏診斷)的大量縱向的QC血清,并且是跨實(shí)驗(yàn)室分布的。
測(cè)定結(jié)果的報(bào)告
實(shí)驗(yàn)室臨床報(bào)告應(yīng)當(dāng)以質(zhì)量單位給出GH結(jié)果(即mg/L)。因?yàn)楸M管采用了一致的標(biāo)準(zhǔn),可能仍然存在不一致之處,也可能因?yàn)榉磻?yīng)物上的差異,所以某些實(shí)驗(yàn)室采用轉(zhuǎn)換因子比較不同測(cè)定方法的結(jié)果。但是,這樣的轉(zhuǎn)換因子不能解釋所有測(cè)定差異,因此不鼓勵(lì)如此使用。
協(xié)作與培訓(xùn)
貫徹使用IS 98/574需要專業(yè)機(jī)構(gòu)、廠商、技術(shù)水平測(cè)試提供者、關(guān)鍵意見領(lǐng)袖(KOL)代表的共同努力。積極培訓(xùn)以及期刊雜志要求研究中使用國際GH測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的政策,也可促進(jìn)參考標(biāo)準(zhǔn)的使用。
在廠商測(cè)定方法文獻(xiàn)中應(yīng)當(dāng)特別說明:參考制劑同一性,校準(zhǔn)信息,包括國際參考標(biāo)準(zhǔn)的可追蹤性,測(cè)定方法與20-kDa GH、胎盤GH和治療的GH類似物的交叉反應(yīng),GHBP干擾,量化的限度,標(biāo)準(zhǔn)參考范圍上下限的測(cè)量性能和QC數(shù)據(jù)。廠商必須通知實(shí)驗(yàn)室有關(guān)影響臨床診斷或治療決定的測(cè)定組成或性能的重要變化。實(shí)驗(yàn)室也必須及時(shí)將這些信息通知給臨床醫(yī)生。
IGF-I測(cè)定方法
IGF-I參考標(biāo)準(zhǔn)的特性
最近已可使用IS 02/254 WHO參考標(biāo)準(zhǔn),這是一種純度>97%的重組標(biāo)準(zhǔn),NIBSC已經(jīng)全面描述了其特性。>20%的實(shí)驗(yàn)室分析了IS 02/254,證明具有生物活性和穩(wěn)定性。如果證明這種標(biāo)準(zhǔn)物可在不同方法中被病人臨床樣本所替代,那么,期刊雜志、團(tuán)體、監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)提倡使用新標(biāo)準(zhǔn),以消除使用不同標(biāo)準(zhǔn)所出現(xiàn)的測(cè)定方法間的差異。雖然不鼓勵(lì)使用轉(zhuǎn)換因子,但在過渡期繼續(xù)使用還是有必要的。但是,只有在相同反應(yīng)物內(nèi)使用轉(zhuǎn)換因子,在不同方法間不能使用IGF-I濃度轉(zhuǎn)換因子。如果標(biāo)準(zhǔn)品是可替代的,應(yīng)當(dāng)使用新標(biāo)準(zhǔn)重新校準(zhǔn)測(cè)定方法,重新確定標(biāo)準(zhǔn)值范圍。
QC樣本的特性
作為確認(rèn)過程的一部分,我們建議確立一組國際間的參考樣本,來監(jiān)測(cè)不同方法的一致性。這些參考樣本由人血清組成,含有低、中、高濃度的IGF-I和GH。使用IGFBPs能夠影響IGF-I測(cè)定結(jié)果的各種疾病的病人(例如,1型糖尿病,慢性腎病,肝硬化和GH紊亂)樣本,直接與不同方法測(cè)定IGF-I測(cè)定結(jié)果比較。這種資料應(yīng)提供給最終的用戶,也應(yīng)提供測(cè)定方法性能特征和受IGFBPs干擾的資料。
IGF-I的生物學(xué)變異
因?yàn)镮GF-I測(cè)定方法有3%~36%的個(gè)體內(nèi)生物學(xué)的不精確性,所以要謹(jǐn)慎解釋一次IGF-I數(shù)值,特別是在接近參考標(biāo)準(zhǔn)的限度時(shí)。應(yīng)當(dāng)以另一血樣重復(fù)測(cè)定限度邊界結(jié)果的樣本。對(duì)結(jié)果的解釋應(yīng)當(dāng)結(jié)合病人的臨床背景,要考慮進(jìn)行其它測(cè)試,例如動(dòng)態(tài)GH刺激/抑制試驗(yàn)。
影響測(cè)定結(jié)果解釋的變量
多種生理變量和臨床狀況影響IGF-I濃度。特別重要的影響變量有年齡、青春期發(fā)育期、妊娠和極端體重指數(shù)(BMI),因此在解釋測(cè)定結(jié)果時(shí)要予以考慮。在成年人,性別和種族是IGF-I濃度變異的較小貢獻(xiàn)因素。晝夜節(jié)律和飲食相關(guān)的變化似乎不影響IGF-I測(cè)量。在I型糖尿病和慢性腎衰竭應(yīng)進(jìn)行測(cè)定的確認(rèn),特定疾病,例如糖尿病,肝和腎病以及營養(yǎng)性損害可影響IGF-I濃度,因此對(duì)這些病人結(jié)果的解釋要謹(jǐn)慎小心。某些藥物,例如口服雌性激素,也影響IGF-I濃度。
影響測(cè)定性能的技術(shù)因素
應(yīng)當(dāng)提供每種測(cè)定方法的樣本搜集和處理方案。建議使用血清。采血試管中的抗凝劑要單獨(dú)進(jìn)行確認(rèn)。在2小時(shí)內(nèi)處理血樣,以防止測(cè)定結(jié)果的人為增加。
影響測(cè)定性能的主要因素是樣本中IGFBPs的存在。理想的測(cè)定方法是無結(jié)合蛋白干擾而識(shí)別IGF-I的測(cè)定方法。一般情況下,IGFBPs干擾IGF-I測(cè)定而產(chǎn)生假的低數(shù)值。在實(shí)踐中,通常使用使IGF-I與IGFBPs分離,然后防止IGFBPs再次與IGF-I結(jié)合的試劑解決這種問題。
應(yīng)當(dāng)確證并說明每種測(cè)定中防止IGFBP干擾的方法,目前消除IGFBP干擾的參考方法是低pH值下的凝膠層析法。所有方法都必須證實(shí)IGFBP干擾已經(jīng)被基本消除(>95%),并應(yīng)當(dāng)說明殘余IGFBPs仍然引起干擾的臨床癥狀。
應(yīng)當(dāng)使醫(yī)生了解特定臨床癥狀下測(cè)定方法的技術(shù)細(xì)節(jié),臨床醫(yī)生也有責(zé)任發(fā)現(xiàn)干擾總血清IGF-I結(jié)果的臨床癥狀。
測(cè)定方法性能的確認(rèn)
廠商應(yīng)當(dāng)在確認(rèn)過程中使用非病理血清,以及GH紊亂、I型糖尿病、慢性腎衰竭和肝硬化病人的血清,并應(yīng)報(bào)告這些資料。測(cè)定的結(jié)果應(yīng)當(dāng)與低pH值下凝膠層析法后的數(shù)值等值。在處理前(藥盒廠商推薦的),為保證無干擾,樣本中應(yīng)添加參考標(biāo)準(zhǔn)范圍上限2倍濃度的IGFBP(IGFBP-2和IGFBP-3)。使用設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)难芯縼碜C明添加的高純度IGF-I的回收。
標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)應(yīng)根據(jù)背景人群隨機(jī)選擇的個(gè)體,該人群樣本應(yīng)包括所有年齡組的代表,排除疾?。ɡ?,肝硬化、糖尿病控制不良、腎衰竭)個(gè)體和服用影響結(jié)果藥物(例如,雌性激素)的個(gè)體。標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)要包括95%的范圍(2.5~97.5百分位數(shù))并以質(zhì)量單位報(bào)告,在對(duì)非常態(tài)數(shù)據(jù)的適當(dāng)轉(zhuǎn)換后,以SD分值表示。
在兒童期和青春期IGF-I濃度變化最大,然后隨年齡的增加變化更加緩慢。為生成標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù),應(yīng)適當(dāng)年齡組分層和標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在兒童和青少年要特別考慮到窄的年齡范圍(例如,每3年)和Tanner發(fā)育分期。在IGF-I濃度迅速變化的年齡期間要與適當(dāng)數(shù)量受試者例數(shù),以保證可靠估價(jià)這些年齡段的參考數(shù)據(jù)范圍。
在6~18歲年齡期間需要以特定性別確定IGF-I參考范圍。在體重指數(shù)22~37kg/m2區(qū)間,IGF-I的變化不大,但在這以數(shù)值區(qū)間的上下,有顯著低的IGF-I數(shù)值。在解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到這個(gè)事實(shí)。
在診斷GH缺乏和過多時(shí),GH刺激和抑制試驗(yàn)是有用的手段。但是,如果不同的測(cè)定方法得出了不同的GH結(jié)果,必須強(qiáng)制性地使用經(jīng)過適當(dāng)確認(rèn)的、特定方法的參考數(shù)據(jù)。這些考慮也包括體重指數(shù)和年齡的影響。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到,由于各種原因,兒童標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的提出具有挑戰(zhàn)性,并受到募集健康兒童參加研究的能力的限制。